@phdthesis{oai:sucra.repo.nii.ac.jp:00018510,
 author = {横山, 奈央},
 month = {},
 note = {144p, 鉄硫黄 (Fe-S) タンパク質は、Fe-Sクラスターをコファクターとして持つタンパク質の総称で、エネルギー代謝から遺伝子の発現制御に至るまで、重要かつ多彩な生理機能を担っている。これらFe-Sタンパク質の機能を支えているのは、Fe-Sクラスターの生合成系であり、これまでに3種類（ISC、SUF、NIFマシナリー）が知られている。これらのマシナリーはどれも、Fe-Sクラスターを新規に組み立てて、それをアポタンパク質まで受け渡すと考えられている。ただし、成分の構成が大きく異なっており、その作動機構には多様性が見られる。 
大腸菌は、iscSUA-hscBA-fdx オペロンとsufABCDSEオペロンにコードされる2種類の生合成系、ISCマシナリーとSUFマシナリーを保持している。通常の生育条件では、ISCマシナリーが主にFe-Sクラスター合成を担っているが、鉄飢餓や酸化ストレス条件下では、SUFマシナリーが発現することが知られている。これらのマシナリーで、共通しているのはシステイン脱硫黄酵素（IscS／SufS）であり、硫黄原子のドナーとして、クラスターの材料となる硫黄原子をそれぞれ、IscU／SufEに渡している。その後、ISCマシナリーでは、IscUにおいてFe-Sクラスターが新規に形成されるのに対し、SUFマシナリーでは、SufEが硫黄原子のキャリアとしてSufBCD複合体に硫黄原子を渡し、この複合体でFe-Sクラスターが新規に形成されることが知られている。 
一方、枯草菌などグラム陽性菌のゲノムには、sufCDSUBオペロンがコードされており、興味深いことに、この生合成系は、ISCマシナリーの成分であるIscUと、SUFマシナリーの4成分SufS、B、C、Dとのキメラ構成と推定される（SUF様マシナリーと呼ぶ）。枯草菌SufSは、大腸菌のIscS／SufSと相同なシステイン脱硫黄酵素で、硫黄原子のドナーとして機能することが示されている。一方、枯草菌のSufU（IscUホモログ）やSufBCDについては、大腸菌のホモログと同様に機能すると考えると、SUF様マシナリーにはFe-Sクラスターの新規形成部位が2か所存在することになる。ただし、SufBCD複合体の精製が極めて困難なため、生化学的な解析は進んでいなかった。そこで、本研究では、遺伝学的なアプローチで、枯草菌SUF様マシナリーの各成分の役割やマシナリーとしての作動機構を解析することにした。
枯草菌のsuf様オペロンの遺伝子はどれも生存に必須なため、in vivoにおける解析もほとんど進んでいなかった。枯草菌は60種類以上のFe-Sタンパク質を保持しているが、それらの機能を洗い直したところ、生存に必須なものはイソプレノイド生合成系（MEP経路）の2つのFe-S酵素、IspG／IspHと推測できた。放線菌など一部のバクテリアや真核生物では、Fe-S酵素が関与しないメバロン酸（MVA）経路でイソプレノイドを合成している。そこで、枯草菌のMEP経路をMVA経路へ改変したところ、suf様オペロンの必須性を回避して、破壊株を構築することに初めて成功した。sufCDSUBの5種類の遺伝子それぞれの破壊株とオペロン全体の欠失株はどれもMVAに完全に依存して生育した。また、これら破壊株におけるFe-S酵素（アコニターゼ、コハク酸脱水素酵素、グルタミン酸合成酵素）の活性を測定したところ、どれも検出限界以下となった。さらに、suf様オペロン破壊株では、バリン、イソロイシン、ロイシンなどのアミノ酸や、プリン・ピリミジンに要求性が見られ、これらの表現型から、それぞれの生合成経路に含まれる Fe-S酵素が機能していないことを確認した。したがって、枯草菌のFe-Sクラスター生合成には、suf様オペロンにコードされる5成分全てが必要であることが判明した。また、変異株の表現型から、枯草菌のFe-Sタンパク質群が全て機能できなくても、それを補う代謝経路を用いることで生育できるようになることがわかった。
構築した枯草菌変異株に、大腸菌isc / sufオペロンの関連遺伝子群を、また逆に、大腸菌変異株に、枯草菌のsuf様オペロンの関連遺伝子群を導入して、異種生物の成分間での互換性を検討した。その結果、SufBCDのうち、SufC、SufDでは、大腸菌／枯草菌どちらにおいても機能的な互換性が認められたが、SufBでは異種間での相補性は認められなかった。ただし、サプレッサー変異の解析から、SufB内の1アミノ酸置換で異種のSufBを代替できるようになることがわかった。したがって、枯草菌のSufBCDは、大腸菌SufBCDと同様に複合体を形成し、Fe-Sクラスターの新規形成部位として機能すると考えられる。 
SufSUについて異種間での相補解析を行ったところ、意外なことに、枯草菌のSufSUは、構造の相同な大腸菌IscSUではなく、大腸菌SufSEと相互に代替できることが判明した。したがって、枯草菌のSufUは、大腸菌IscUのようにFe-Sクラスターの新規形成部位として機能するのではなく、大腸菌SufEと同様に、硫黄原子のキャリアとして機能することがわかった。すなわち、SufUとIscUが機能の異なる相同タンパク質であることを明確に示した。これらの知見を統合すると、枯草菌SUF様マシナリーでは、 SufSからSufU、SufBCD複合体の順に硫黄原子が受け渡され、SufBCD複合体においてFe-Sクラスターが新規に形成されると考えられる。
SufU / IscUに相同な794種類のアミノ酸配列について分子系統関係を調べたところ、これらの配列は、SufUグループとIscUグループの2つの大きなサブファミリーに分離した。したがって、SufUとIscUは、共通祖先から分岐した後、異なる機能（それぞれ、硫黄原子のキャリア／Fe-Sクラスターの足場）を持つように進化したと考えられる。さらに、SufU / IscUの系統関係に加えて、種々の生合成マシナリーに特徴的な成分の分布を考え合わせることで、多様なFe-Sクラスター生合成系がどのように進化してきたのか、その道筋を示すことができた。, 概要 .............................................................................................................................................................. 1
序章 .............................................................................................................................................................. 4
　鉄硫黄（Fe-S）クラスターとFe-S タンパク質 ...................................................................................... 5
　Fe-S クラスターの生合成系 .................................................................................................................... 6
　― NIF マシナリー ............................................................................................................................... 7
　― ISC マシナリー ............................................................................................................................... 8
　― SUF マシナリー ............................................................................................................................ 11
　― ISC／SUF のキメラ型生合成系：SUF 様マシナリー ................................................................... 16
　本研究の目的とアプローチ .................................................................................................................... 18
第 1 章 枯草菌 suf 様オペロン破壊株の構築とその性質 ......................................................................... 21
　1.1 序 ................................................................................................................................................... 22
　1.2 材料および実験方法 ...................................................................................................................... 23
　　1.2.1 枯草菌の suf 様オペロン破壊株の構築と培養条件 ................................................................. 23
　　　suf 様オペロン破壊株の栄養要求性の検討 ........................................................................... 24
　　　suf 様オペロン破壊株の形質転換 ......................................................................................... 24
　　1.2.2 プラスミドの構築 .................................................................................................................. 25
　　　MVA 経路の遺伝子発現用プラスミド pBMV4 の構築 ........................................................... 25
　　　相補実験用プラスミド（pHCMC05 シリーズ）の構築 ........................................................ 26
　　1.2.3 酵素活性の測定 ...................................................................................................................... 28
　　　アコニターゼ活性の測定 ...................................................................................................... 28
　　　コハク酸脱水素酵素の活性 .................................................................................................. 29
　　　グルタミン酸合成酵素の活性 ............................................................................................... 30
　　　リンゴ酸脱水素酵素の活性 .................................................................................................. 31
　1.3 結果 ............................................................................................................................................... 32
　　1.3.1 suf 様オペロン破壊株の構築 .................................................................................................. 32
　　1.3.2 suf 様オペロン破壊株の表現型（富栄養培地における生育） ................................................ 35
　　1.3.3 suf 様オペロン破壊株における Fe-S 酵素の機能不全 ............................................................ 36
　　1.3.4 suf 様オペロン破壊株の栄養要求性 ....................................................................................... 37
　　1.3.5 suf 様オペロン破壊株の形質転換 ........................................................................................... 39
　1.4 考察 ............................................................................................................................................... 42
　　1.4.1 SUF 様マシナリーは枯草菌で唯一の Fe-S クラスター生合成として機能する ...................... 42
　　1.4.2 suf 様オペロン破壊株の栄養要求性と Fe-S タンパク質の機能不全 ...................................... 43
　　1.4.3 suf 様オペロン破壊株におけるエネルギー代謝 ..................................................................... 45
　　1.4.4 Fe-S クラスター生合成系を持たない枯草菌 .......................................................................... 47
第 2 章 Fe-S クラスター生合成系の遺伝学的解析と進化的考察 ............................................................. 49 
　2.1 序 ..................................................................................................................................................... 50
　2.2 材料および実験方法 ...................................................................................................................... 51
　　2.2.1 菌株と培養条件 ...................................................................................................................... 51
　　2.2.2 プラスミドの構築 .................................................................................................................. 51
　　　枯草菌相補実験用プラスミド（pHCMC05 シリーズ）の構築 ............................................. 51
　　　大腸菌相補実験用プラスミド（pBBR・pRK シリーズ）の構築 .......................................... 53
　　　Error prone PCR によるランダム変異の導入 ....................................................................... 55
　　2.2.3 IscU/SufU の系統解析 ............................................................................................................ 55
　2.3 結果 ............................................................................................................................................... 57
　　2.3.1 枯草菌の suf 様オペロン破壊株を用いた異種間相補解析 ...................................................... 57
　　2.3.2 大腸菌変異株用いた異種間相補解析 ...................................................................................... 60
　　2.3.3 SufB の種特異性を変化させるサプレッサー変異 .................................................................. 62
　　2.3.4 枯草菌 SufU で保存されたアミノ酸の機能性 ........................................................................ 63
　　2.3.5 IscU／SufU の分子系統解析 .................................................................................................. 64
　2.4 考察 ............................................................................................................................................... 69
　　2.4.1 枯草菌 SUF 様マシナリーにおける SufBCD 複合体の機能 ................................................... 69
　　2.4.2 枯草菌 SUF 様マシナリーにおける SufU の機能 ................................................................... 71
　　2.4.3 IscU／SufU の機能分化と Fe-S クラスター生合成系の進化的変遷 ....................................... 74
　2.5 今後の展望 .................................................................................................................................... 78
参考文献 ..................................................................................................................................................... 82, 指導教員 : 高橋康弘, text, application/pdf},
 school = {埼玉大学},
 title = {枯草菌における鉄硫黄クラスター生合成系の研究},
 year = {2018},
 yomi = {ヨコヤマ, ナオ}
}